تست PCR: ایمنی، روش، اهمیت

آزمایش PCR چیست؟

آزمایش PCR یک روش آزمایشگاهی است که در زیست شناسی مولکولی و پزشکی استفاده می شود. این آزمایش برای تشخیص مستقیم - و خصوصیات - مواد ژنتیکی استفاده می شود. روش PCR توسط متخصصان آسان برای انجام، کاربرد جهانی و قوی در نظر گرفته شده است.

در آزمایشگاه، آزمایش PCR شامل دو مرحله است. در مرحله اول، ماده ژنتیکی موجود با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکثیر می شود. این اجازه می دهد تا کوچکترین آثار DNA مورد بررسی قرار گیرد. همچنین به همین دلیل است که تست‌های PCR با حساسیت واکنش نشان می‌دهند.

در مرحله دوم، ماده ژنتیکی با توجه به ویژگی‌های آن جدا، «مرتب‌سازی» و به این ترتیب مشخص می‌شود. به عبارت دیگر، ساختار ظریف DNA تعیین می شود.

کاربردهای زیادی وجود دارد: پزشکان از آزمایش PCR استفاده می‌کنند، به عنوان مثال، برای بررسی سواب‌ها از نظر وجود ویروس کرونا، اهدای خون برای HIV یا غربالگری نوزادان از نظر بیماری‌های ارثی احتمالی. عفونت های باکتریایی - برای مثال با پاتوژن سل - یا عفونت های انگلی (مالاریا) نیز می توانند با استفاده از PCR روشن شوند.

آنها همچنین به محکومیت مجرمان در پزشکی قانونی بر اساس اثر انگشت ژنتیکی آنها کمک می کنند یا به عنوان آزمایش پدری استفاده می شوند.

تست PCR چقدر معتبر است؟

نتیجه آزمایش PCR معمولاً تا 48 ساعت از زمان نمونه برداری معتبر است.

تست PCR چقدر قابل اعتماد است؟

PCR یک روش تشخیص آزمایش شده و آزمایش شده در تشخیص مولکولی و پزشکی است. به عنوان استاندارد طلایی با نرخ خطای بسیار پایین در نظر گرفته می شود. تست ها به ویژه با حساسیت و ویژگی بسیار بالا مشخص می شوند.

حساسیت به معنای قابلیت اطمینانی است که با آن یک آزمایش ماده ژنتیکی را که باید تشخیص داده شود، پیدا می کند.

Specificity به معنای اطمینانی است که با آن آزمایش مشخص می کند که ماده ژنتیکی مورد نظر در نمونه وجود ندارد.

تست‌های PCR چه زمانی برای عفونت Sars-CoV-2 کار می‌کنند؟

به عنوان یک قاعده، آزمایش PCR عفونت کرونا را دو تا سه روز قبل و تا 20 روز پس از شروع علائم تشخیص می دهد. حتی در افراد آلوده که کاملاً بدون علائم باقی می مانند، این آزمایش در یک بازه زمانی بحرانی که می توانند دیگران را آلوده کنند مؤثر است.

در موارد فردی، تشخیص حتی 60 روز پس از شروع علائم امکان پذیر است.

منابع احتمالی خطا

میزان خطا در فرآیند کپی DNA در عمل ناچیز است. اگرچه DNA پلیمرازها هرگز بدون خطا نیستند، اما نقش مهمی در روش آزمایش PCR ندارند.

در عمل، منابع بالقوه خطا بیشتر در مجموعه نمونه نهفته است: بنابراین مهم است که متخصصان پزشکی آموزش دیده سواب ها را انجام دهند. نمونه‌های بزاق و غرغره احتمالاً می‌توانند دقت آزمایش را کاهش دهند، زیرا اثرات رقیق‌سازی در اینجا رخ می‌دهد.

آزمایش PCR چگونه کار می کند؟

آزمایش PCR، به عنوان مثال، توسط پزشک خانواده یا در مراکز آزمایش ویژه انجام می شود. ابتدا پزشکان یا متخصصان پزشکی آموزش دیده نمونه برداری می کنند. معمولاً برای آزمایش از دستگاه تنفسی فوقانی سواب گرفته می شود. این معمولاً به شکل سواب دهان یا نازوفارنکس است.

غرغره کردن با محلول شستشو نیز امکان پذیر است. نمونه خون برای تشخیص کرونا غیر معمول است - اما به طور گسترده در غربالگری نوزادان استفاده می شود.

صرف نظر از نوع نمونه گرفته شده، مواد ژنتیکی روی سواب پنبه، محلول شستشو یا در قطره خون یافت می شود. این ماده نمونه به آزمایشگاه فرستاده می شود و در آنجا جداسازی و خالص سازی می شود.

سپس آزمایش PCR به دو مرحله تقسیم می شود:

• PCR: در این مرحله مقدار ماده ژنتیکی اولیه تقویت می شود.

مرحله 1: PCR - "واکنش زنجیره ای پلیمراز"

"PCR" اولین مرحله از دو مرحله است: اینجا جایی است که مقدار DNA اولیه موجود تقویت می شود. این به این دلیل است که ماده ژنتیکی تنها زمانی قابل تجزیه و تحلیل است که به مقدار کافی در دسترس باشد. در بیشتر موارد، این DNA انسان است. در مورد آزمایشات ویروس کرونا، RNA ویروسی است.

PCR مخفف عبارت "واکنش زنجیره ای پلیمراز" است.

چه چیزی برای PCR لازم است؟

DNA شروع در یک ظرف واکنش با مواد خاصی قرار می گیرد. ماده ژنتیکی موجود به عنوان یک الگو عمل می‌کند که در حضور آنزیم‌های خاص (Taq polymerase) و بلوک‌های ساختمانی اصلی DNA کپی می‌شود.

فرآیند کپی در چندین دوره (چرخه) تکراری انجام می شود.

به طور خاص، مواد زیر با هم جمع می شوند:

• DNA شروع: ماده نمونه ای که قرار است کپی شود.
• بلوک‌های اصلی سازنده DNA: اینها نوکلئوبازهای آدنین، تیمین، سیتوزین و گوانین هستند.
• DNA پلیمراز: آنزیمی که واحدهای سازنده DNA را به هم متصل می کند تا یک رشته DNA کاملاً تعریف شده را تشکیل دهد. رشته تازه به دست آمده یک تصویر آینه ای (مکمل) از ماده اولیه اولیه است.
• پرایمرها: از 16 تا 24 جفت پایه تشکیل شده و به عنوان موقعیت شروع و سیگنال شروع عمل می کنند. پرایمرها DNA پلیمراز را نشان می دهند که در آن موقعیت (DNA اولیه) فرآیند کپی آغاز می شود.

آزمایش PCR چگونه انجام می شود؟

اکنون که تمام مواد مورد نیاز برای PCR در ظرف واکنش وجود دارد، فرآیند کپی برداری واقعی از ماده ژنتیکی می تواند آغاز شود. این فقط توسط دما شروع می شود، کنترل می شود و دوباره متوقف می شود.

بنابراین ظرف واکنش یکی پس از دیگری در دماهای مختلف گرم یا سرد می شود. این کار با استفاده از دستگاه خاصی به نام چرخه حرارتی انجام می شود. کل واکنش حدود یک تا دو ساعت طول می کشد.

مراحل جداگانه یک چرخه PCR عبارتند از

• دناتوره شدن دو رشته DNA: نمونه تا حدود 90 درجه سانتیگراد گرم می شود. این رشته دو رشته DNA اصلی را به دو رشته منفرد (مکمل) جدا می کند.
• چسباندن پرایمرها: دما را تا کمی زیر 60 درجه سانتیگراد کاهش می دهند. این باعث می شود پرایمرها (پرایمر جلو، پرایمر معکوس) به موقعیت های مشخص شده روی رشته های DNA منفرد مربوطه بچسبند.

پس از یک چرخه کامل، دما دوباره به حدود 90 درجه سانتیگراد افزایش می یابد - چرخه دوباره از ابتدا شروع می شود.

روش PCR می تواند برای تقویت توالی های DNA تا حدود سه جفت کیلوباز (kbp) استفاده شود. این مربوط به حدود 3,000 بلوک اصلی سازنده DNA است که به یکدیگر متصل شده اند تا یک "زنجیره" را تشکیل دهند. برای مقایسه: ژنوم انسان نقشه‌ها و اطلاعات مربوط به عملکرد سلول را در حدود سه میلیارد جفت پایه ذخیره می‌کند – از سوی دیگر، ژنوم کروناویروس از 30,000 جفت پایه تشکیل شده است. بنابراین آزمایش PCR تنها می تواند بخش های کوتاهی از DNA کل را تقویت و بررسی کند.

پرایمرها بسیار مهم هستند

انتخاب پرایمرها برای روش PCR بسیار مهم است. به عنوان مثال، در تشخیص Sars-CoV-2 از چندین پرایمر (مولتی پلکس PCR) استفاده می شود.

بنابراین آزمایش‌های Corona PCR برای سه ژن مختلف ویروس جستجو می‌کنند: این ویژگی ویژگی کلی را تقریباً به 99.99 درصد افزایش می‌دهد. این بدان معنی است که با این نرخ ضربه بالا، تنها یک تست مثبت کاذب در هر 10,000 آزمایش وجود دارد (اگر نمونه ها به درستی گرفته شوند).

چه مقدار ماده ژنتیکی کپی شده در حال حاضر موجود است؟

اجازه دهید فرض کنیم که دو رشته دو رشته DNA یکسان پس از چرخه اول وجود دارد.

پس از هر چرخه، مقدار (کپی شده) ماده ژنتیکی دو برابر می شود. بنابراین مقدار DNA به طور تصاعدی رشد می کند.

پزشکان معمولاً این فرآیند را حدود بیست تا سی بار تکرار می کنند.

از نظر تصویری، این بدان معنی است که حتی اگر در ابتدا فقط یک تک رشته DNA دو رشته ای در نمونه یافت شود، پس از بیست چرخه در حال حاضر یک میلیون نسخه مشابه در ظرف واکنش وجود دارد.

مقدار Ct به چه معناست؟

تعداد چرخه های PCR اجرا شده به شکل مقدار Ct نشان داده می شود. "Ct" از اصطلاح انگلیسی "cycle threshold" گرفته شده است. این مقدار Ct این امکان را فراهم می کند که در مورد مقدار ماده ژنتیکی مورد جستجو اظهار نظر کنید.

با مقدار کم Ct 20، مواد ژنتیکی اولیه زیادی وجود دارد. با این حال، اگر مقدار Ct بالا باشد - حدود 30 سیکل - به نسبت کمی DNA وجود دارد. بنابراین چرخه PCR باید بیشتر اجرا شود.

مرحله 2: الکتروفورز "مرتب سازی بر اساس اندازه"

هنگامی که مواد ژنتیکی "غنی" کافی در دسترس بود، می توان الکتروفورز را انجام داد. در این فرآیند، دانشمندان از یک ویژگی خاص DNA بهره برداری می کنند: بار الکتریکی آن.

تک تک واحدهای سازنده DNA از طریق یک ستون فقرات قند فسفات باردار (منفی) به یکدیگر مرتبط می شوند. هر چه یک توالی DNA خاص طولانی تر باشد، بار الکتریکی آن بیشتر است.

این اجازه می دهد تا ماده ژنتیکی بررسی و مشخص شود. در عمل، یک نمونه ناشناخته معمولاً در برابر یک مرجع شناخته شده در یک "خط شروع" رسم می شود و پس از مدت زمان معینی با یکدیگر مقایسه می شود.

اگر "سرعت مهاجرت" برای هر دو توالی یکسان باشد، به این معنی است که تشخیص به احتمال زیاد مثبت است: تشخیص به احتمال زیاد مثبت است - ژنی که شما به دنبال آن هستید در نمونه موجود است.

مورد خاص ویروس کرونا: آماده سازی نمونه و RT-PCR

تشخیص ویروس کرونا یک مورد خاص است. Sars-CoV-2 یکی از ویروس های به اصطلاح RNA است. این بدان معناست که ماده ژنتیکی Sars-CoV-2 به شکل RNA (ریبونوکلئیک اسید) وجود دارد.

RNA تنها از چند جنبه با DNA متفاوت است. از جمله اینکه به صورت یک رشته وجود دارد و به جای 2'-دئوکسی ریبوز بر پایه قند ریبوز است. نوکلئوباز تیمین نیز با اوراسیل به عنوان پایه چهارم جایگزین می شود.

این RNA ویروسی باید قبل از آزمایش PCR معمولی به DNA "رونویسی" شود. این فرآیند رونویسی معکوس (RT) نامیده می شود - از این رو اصطلاح RT-PCR نامیده می شود. یک رشته از cDNA ("DNA مکمل") به عنوان بخشی از این فرآیند به دست می آید. در مرحله بعدی، تک رشته cDNA توسط یک رشته DNA مشابه آینه ای تکمیل می شود.

چقدر طول می کشد تا به نتیجه برسید؟

هنگامی که نمونه به آزمایشگاه فرستاده شد، معمولاً یک یا دو روز کاری نتیجه را دریافت خواهید کرد. در مراکز آزمایش، که اغلب نمونه ها را مستقیماً در محل بررسی می کنند، ممکن است فقط چند ساعت طول بکشد. بازه زمانی تا حد زیادی به مرکز آزمون مربوطه و تدارکات آن بستگی دارد.

با وجود فرآیندهای کاری پیچیده، آزمایشگاه های مدرن قادر به انجام آزمایشات PCR با توان عملیاتی بالا هستند. دستگاه های خودکار ویژه به انجام آزمایشات کمک می کنند.

با این وجود، آزمایش PCR یک روش تشخیص نسبتاً "آهسته" اما مطمئن تر در نظر گرفته می شود.

اگر نتیجه مثبت باشد چه اتفاقی می افتد؟

اگر نمونه به درستی گرفته شود، مثبت بودن تست PCR به این معنی است که احتمال بسیار بالایی وجود دارد که فرد مورد آزمایش به Sars-CoV-2 آلوده شده باشد.

در صورتی که با استفاده از تست PCR ابتلای شما به ویروس کرونا تایید شد، اداره بهداشت عمومی از آزمایشگاه مربوطه اطلاعیه نتیجه آزمایش مثبت را دریافت خواهد کرد. در چنین حالتی، اداره بهداشت عمومی دستور ایزوله یا قرنطینه را صادر می کند.

آیا اگر آزمایش PCR مثبت باشد، به طور خودکار مسری هستم؟

معمولا بله. اما نه همیشه. نتیجه آزمایش PCR همیشه باید در متن تفسیر شود. مثبت بودن تست اول از همه به این معنی است که شما حامل مواد ویروسی هستید.

آزمایش آنتی بادی مکمل گاهی اوقات مفید است

در چنین مواردی، آزمایش آنتی بادی اطمینانی را ارائه می دهد که اعتبار آزمایش PCR را تأیید می کند. بهتر است این موضوع را با پزشک خود در میان بگذارید. آنها می توانند به شما در تفسیر صحیح نتیجه آزمایش PCR کمک کنند.

در صورت منفی بودن نتیجه چه باید کرد؟

نتیجه آزمایش PCR منفی به احتمال زیاد به این معنی است که شما در زمان نمونه برداری کووید-19 نداشتید و بنابراین در حال حاضر عفونی نیستید. با این حال، ممکن است در مرحله اولیه عفونت باشید.

عفونت‌های کرونا معمولاً تنها از روز دوم یا سوم پس از عفونت قابل تشخیص هستند. بنابراین نتیجه یک پاس آزاد نیست. بنابراین شما باید به رعایت فاصله اجتماعی و قوانین بهداشت ادامه دهید و به استفاده از ماسک FFP2 - برای محافظت از خود و دیگران - ادامه دهید.

تست PCR برای کودکان

آزمایش PCR برای کودکان هیچ تفاوتی با آزمایش PCR برای بزرگسالان ندارد. هم جمع آوری نمونه و هم تفسیر نتایج برای کودکان و همچنین بزرگسالان کاربرد دارد.

خطرات آزمایش PCR چیست؟

آزمایش PCR هیچ خطر فیزیکی ندارد. فقط جمع‌آوری نمونه با سواب نازوفارنکس توسط برخی افراد آزاردهنده یا ناخوشایند تلقی می‌شود.

هزینه آزمایش PCR چقدر است؟

لطفا توجه داشته باشید: اگر خود را در خانه آزمایش کرده اید و نتیجه مثبت دریافت کرده اید، باید فوراً از طریق تلفن با پزشک عمومی خود وقت بگیرید. پزشک مراحل بعدی را از طریق تلفن با شما در میان خواهد گذاشت.

از طرف دیگر، بهتر است برای ثبت نام برای آزمایش PCR با شماره 116 117 تماس بگیرید. در حالت ایده‌آل، شما باید تا زمان تست تایید در خانه بمانید تا از خود و دیگران محافظت کنید.